本试剂为4％多聚甲醛，由0.1M PB溶解。未经DEPC处理。

本试剂为-20度保存，如果经常使用，可放2-8度。解冻后，混匀使用。

关于固定方法与时间，以及适合标本，请自行参考文献。

以下资料收集于网络，仅供参考。

不同固定方法对新生大鼠脑组织切片的影响

【摘要】  目的：观察应用与不应用多聚甲醛心脏灌注这两种不同固定方法对新生大鼠脑组织切片的影响。方法：20只新生大鼠随机化分为灌注组与非灌注组，每组各10只。灌注组经麻醉后经左心室插入灌流针，先灌注冰冻无菌生理盐水再灌注4％多聚甲醛，灌注同时切开小部分肝脏，断头取脑，多聚甲醛浸泡固定24小时，再经70％、80％、95％、100％乙醇及二甲苯浸泡，石蜡包埋。非灌注组新生大鼠经麻醉后直接断头取脑，其它固定方法同灌注组。进行石蜡切片HE染色观察鼠脑组织结构。结果：灌注组脑组织切片组织结构清晰，无共染现象, 组织切片完整均匀，皮层及海马区组织、细胞形态正常，未见扩张的毛细血管。非灌注组大脑皮层及海马区组织水肿，细胞周围间隙增宽，胞体肿胀，有些细胞边界模糊不清，核着色不良，部分视野可见扩张的毛细血管，血管内有血细胞样物。结论：应用多聚甲醛心脏灌注对新生大鼠脑组织的固定效果较好，是应用动物脑组织切片进行形态学研究实验的*的步骤。

【关键词】  新生大鼠 大脑 组织固定 组织切片

    新生大鼠脑组织切片是观察新生大鼠脑组织病理损伤的主要实验方法之一。在进行脑组织切片之前，需对处死的新生大鼠鼠脑进行固定。有文献表述直接把处死的鼠脑浸泡在4％多聚甲醛溶液中固定，也有文献介绍应用在体心脏灌流术经心脏灌注4％多聚甲醛后再浸泡固定方法［1］。为对比这两种方法对新生大鼠脑组织切片的影响，我们在进行新生大鼠实验中分别应用这两种方法，观察直接固定与在体心脏灌流术后固定对新生大鼠脑组织切片的影响。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料 

　　多聚甲醛由广州化学试剂厂生产，4%多聚甲醛临用前配制，配制后过滤去除小的杂质，配制后放置到冰箱中，冷却到4 ℃后使用。Motic Med6.0数码医学图像分析系统及Olympus CHC-212生物显微镜为日本公司生产。

　　1.2  动物分组 

　　7日龄新生SD大鼠性别不限，体重10～15 g，共20只，由广东医学院实验动物中心提供。实验动物编号，采用随机数字表进行随机化分为灌注组与非灌注组，每组各10只。

　　1.3  新生大鼠大脑组织固定与样本准备 

　　灌注组新生大鼠经乙mi吸入麻醉后固定于自制的手术木板上，置于解剖盘中，开胸暴露并游离出心脏，切开右心房，经左心室插入灌流针并固定，灌注同时切开小部分肝脏，先灌注冰冻无菌生理盐水（4 ℃）30～50 mL直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清，后再灌注冰冻（4 ℃）4％多聚甲醛30～50 mL，断头取脑，多聚甲醛浸泡固定24小时，再经70％、80％、95％、100％乙醇及二甲苯浸泡，石蜡包埋。非灌注组新生大鼠经乙mi吸入麻醉后直接断头取脑，多聚甲醛浸泡固定24小时，其它固定方法同灌注组。

　　1.4  样本切片与HE染色 

　　切片自视交叉冠状平面开始，切至出现海马结构，片厚5 μm，每隔5张取1张，每个标本取10张，黏于多聚赖氨酸处理后的切片上，进行HE染色观察鼠脑组织结构。每张脑切片取左侧颞顶叶皮层及左侧海马CA1区中段随机各取6个视野拍照。

　　2  结果

    灌注组应用4%多聚甲醛灌注过程中观察到新生大鼠四肢抽搐、四肢及尾巴僵硬、全身强直现象。灌注组新生大鼠大脑组织切片组织结构清晰，细胞核染色鲜艳，核无明显肿胀，核浆对比度好，无共染现象, 组织切片更加完整均匀，镜下与石蜡切片相似，皮层及海马区组织、细胞形态正常。未见扩张的毛细血管。见图1、图2。非灌注组新生大鼠大脑皮层及海马区组织水肿，细胞周围间隙增宽，胞体肿胀，有些细胞边界模糊不清，细胞核着色不均，部分视野可见扩张的毛细血管，血管内有血细胞样物。见图3、图4。
  
　　3  讨论

    病理标本的制作和组织切片都必须先进行固定。如果固定不佳，制片的其它程序将白费时间，没有很好的固定，HE染色就难以进行。新生大鼠脑组织切片常用于对新生大鼠脑形态学影响的研究，比如免疫组化、细胞凋亡等实验。组织的固定是形态学研究中*的重要步骤。组织的固定有以下作用：抑制细胞内溶酶体酶的释放和活性，防止自溶；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织腐坏，使细胞的蛋白质、脂肪、糖等各种成分凝固成不溶性物质，以防止物质扩散并维持原有的组织形态结构； 固定后的组织对染料有不同的亲和力，染色后可产生不同的折射率，颜色更为清晰鲜明，便于观察，硬化组织，便于切片［2］。还可将抗原固定在原位，保持其抗原性，使抗原能准确可靠地显示出来［3］。在进行动物脑实验应用的固定剂中，zui常用的是多聚甲醛［4，5］。有研究认为应用4%的多聚甲醛磷酸缓冲液固定效果［6］。

    我们实验结果表明，应用4％多聚甲醛心脏灌注及脑标本浸泡对新生大鼠脑组织的固定效果较好，组织切片组织结构清晰完整，染色满意。而不用4％多聚甲醛心脏灌注仅脑标本浸泡固定的效果就相对较差，组织水肿，细胞周围间隙增宽，胞体肿胀，有些细胞边界模糊不清，染色欠满意。说明应用4％多聚甲醛心脏灌注这一步骤*。我们分析认为应用4％多聚甲醛心脏灌注可能有如下作用：①标本血管冲洗，减少血管内血液有形成分存留，影响切片形态学观察。②多聚甲醛经毛细血管快速渗入组织中起固定作用。而不进行心脏灌注仅仅标本浸泡，多聚甲醛可能要经较长时间才能渗入组织中起固定作用。尤其固定较大的标本时固定剂需更长时间才能渗入组织中。我们应用的新生大鼠脑标本远较大鼠小。③减少组织细胞自溶现象。我们实验未观察到明显的细胞自溶现象。但部分细胞肿胀，可能由于脑标本尚小的原因，不排除对于较大标本会进一步发生细胞自溶现象。

【参考文献】
  　　［1］刘乃慧，张莉，邵颖，等. 在体心脏灌流术在大鼠脑组织切片观察中的应用［J］.实验动物科学与管理，2005，22（2）：52－53.

　　［2］黄宏森，张超，郭晓珍，等. 不同固定液及固定时间对小鼠肝组织结构的影响［J］.广州医学院学报，2007，35（2）：65－68.

　　［3］郁毅刚，徐如祥，姜晓丹，等. 固定方式对神经细胞膜NMDAR1免疫细胞化学定位的影响［J］.*军医大学学报，2004，24（4）：379－385.

　　［4］雷种，成丹丹，王百忍，等. 局灶性脑缺血再灌注后大鼠下丘脑pSTAT3阳性神经细胞分布与局部微血管的关系［J］.中华麻醉学杂志，2007，27（9）：827－830.

　　［5］葛鹏飞，罗毅男，付双林，等. 缺血再灌注对大鼠海马CA1及DG神经元内19S蛋白酶体影响的激光扫描共聚焦显微镜研究［J］.中华神经医学杂志，2006，5（12）：1216－1218.

　　［6］贺莉萍，郭毅，蒙艳斌，等. 固定剂和固定时间对石蜡包埋组织RT-PCR检测病毒RNA的影响［J］.国外医学·流行病学传染病学分册，2005，32（1）：11－15.